烟酸对动脉粥样硬化兔逆胆固醇转运的促进作用观察

周珊珊,  郭志刚,  吴佳易,  赖文岩,   屠燕

[摘要] ：目的　探讨烟酸促进动脉粥样硬化(AS)兔逆胆固醇转运(RCT)的作用及其可能机制。方法　健康雄性新西兰白兔12只,随机均分为对照组(给予单纯高脂饮食建立AS 模型) 及烟酸组[在高脂饮食基础上,每日给予口服烟酸400mg/ (kg ·d) ]。6 周后,取两组动物外周血单核细胞、腹腔巨噬细胞、腹部皮下脂肪细胞、肝细胞,流式细胞仪检测ATP 结合盒转运子A1 (ABCA1) 表达量,液相闪烁计数法检测[3 H]胆固醇转出率;酶法和免疫方法检测兔血脂及主动脉组织、脂肪组织、肝组织的总胆固醇(TC) 、非高密度脂蛋白胆固醇(NHDL2C) 、高密度脂蛋白胆固醇(HDL2C) 、载脂蛋白A1(apoA1) 含量变化; Image2Pro Plus Version 610 图像分析软件对比测定两组AS 斑块面积。结果　与对照组相比,烟酸组TC、NHDL2C明显下降,HDL2C、apoA1 明显上升( P < 0101) ,单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞的ABCA1 表达量及胆固醇转出率均明显上升,而肝细胞ABCA1 表达量、胆固醇转出率则明显下降( P < 0101) ,主动脉、脂肪组织、肝组织中胆固醇含量明显减少( P < 0101) ,AS 斑块面积显著减小( P< 0105) 。结论　烟酸能明显改善血脂谱,增加外周细胞ABCA1 表达量及胆固醇转出率,降低主动脉AS 面积及组织中胆固醇含量。巨噬细胞ABCA1 表达量可作为反映体内RCT 水平的间接指标。

[关键词] 　动脉粥样硬化;ATP 结合匣式转运子;胆固醇;尼克酸

[中图分类号] 　R97216 　[文献标志码] 　A 　[文章编号] 　057727402(2010) 0320256204

Mechanism of niacin in promoting the reverse cholesterol transport in atherosclerotic rabbits

ZHOU Shan2shan , GUO Zhi2gang3 , WU Jia2yi , LAI Wen2yan , TU Yan1 Department of Cardiology , Nanfang

Hospital , Southern Medical University , Guangzhou 510515 , China＊Corresponding author , E2mail : guozhigang126@1261com

[ Abstract] 　Objective 　To investigate the protective effect and possible anti2atherosclerotic mechanism of nicotinic acid on reversecholesterol transport (RCT) in atherosclerotic rabbits. Methods 　Twelve rabbits were randomly divided into two groups (6 each) : controlgroup (rabbits were fed with high cholesterol diet for 6 weeks) and niacin group [ rabbits were fed with high cholesterol diet supplementedwith 400mg/ (kg ·d) niacin for 6 weeks ]. After the different treatments for 6 weeks , ATP2binding cassette transporter 1 (ABCA1)expression in macrophages , adipocytes and hepatic cells were evaluated with flow cytometry , [3 H] cholesterol efflux rates were analyzedwith liquid scintillation counting. Total cholesterol ( TC) contents , non high2density lipoprotein cholesterol (NHDL2C) , high2densitylipoprotein cholesterol ( HDL2C) and apolipoprotein A1 (apoA1) in aorta , adipose and liver tissues were measured by enzymatic andimmunologic method. The atherosclerotic area in aorta was calculated by Image2Pro Plus Version 610 software. Results 　Compared withcontrol group , TC contents and NHDL2C decreased , but HDL2C and apoA1 increased in niacin group ( P< 0101) . ABCA1 expressions andcholesterol efflux rates in monocytes macrophages , adipocytes were higher , but ABCA1 expressions and cholesterol efflux rates werelower in hepatocytes in niacin group compared with control group ( P< 0101) . The cholesterol contents in aorta , adipose and liver tissuesdecreased in niacin group compared with control group ( P < 0101) . Aortic atherosclerotic area was significantly reduced in niacin group

compared with that in control group ( P < 0105) . Conclusions 　Niacin can significantly improve the lipid profile , up2regulate ABCA1expressions and cholesterol efflux of peritoneal cells , thus leads to decrease of the atherosclerosis area in aorta and cholesterol contents in tissues. ABCA1 expression in macrophages may be used as an indirect index of RCT in vivo.

[ Key words] 　atherosclerosis ; ATP2binding cassette transporters ; cholesterol ; niacin

　虽然他汀类药物在动脉粥样硬化(atherosclerosis ,AS)及冠心病(coronary artery disease ,CAD) 的防治中有重要作用,但目前其降脂效果并不十分理想。2005年在巴赛罗纳举行的“升高高密度脂蛋白胆固醇国际专题讨论会”上,将升高高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol ,HDL2C)防治AS 及CAD的作用提到了重要高度。高密度脂蛋白在逆胆固醇转运(reverse cholesterol transport ,RCT) 机制中具有重要作用, 而ATP 结合的盒转运子A1 (ATP2bindingcassette transporter A1 ,ABCA1)是升高HDL2C及增加RCT 的关键基因,动物实验也为巨噬细胞ABCA1 的心血管保护作用提供了证据[1] 。烟酸是目前升高HDL2C最有效的药物,具有全面而独特的调脂作用,但研究资料相对较少,虽有文献报道其可增加脂肪细胞胆固醇转出率[2] ,但烟酸与ABCA1 之间的关系,尤其是烟酸抗AS 的机制研究仍较少。本实验探讨了烟酸对AS 兔RCT 的促进作用,以期为AS 的发生机制和治疗提供新的依据.

1 　材料与方法

1．1 　实验动物及分组　健康雄性新西兰白兔12 只,体重210 ±011kg ,购自南方医科大学实验动物中心(合格证号:0025759) 。以1 %胆固醇、0105 %胆盐、5 %猪油加入普通饲料内配制成高胆固醇饮食饲料。采用随机数字表将12 只兔均分为对照组(给予单纯高脂饮食建

立AS 兔模型)和烟酸组[在高脂饮食基础上,每日给予口服烟酸400mg/ (kg ·d) ]。

1.2血脂含量的检测　分别于实验的0、6 周在空腹12h 状态下抽取兔耳缘静脉血,利用OlympusAU5421 型全自动生化分析仪测定总胆固醇(total cho2lesterol ,TC) 、HDL2C、低密度脂蛋白胆固醇(low densi2ty lipoprotein cholesterol ,LDL2C) 、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein cholesterol ,VLDL2C) 水平,利用免疫比浊法通过752 型分光光度计测定载脂蛋白A1(apolipoprotein A1 ,apoA1)含量。

1．3 　LDL 的制备、氧化修饰及修饰程度测定　取正常人新鲜血200ml ( EDTA 抗凝) ,用KBr 调整密度至1130g/ ml ,4 ℃下50 000r/ min 离心5h ,使LDL 与血浆其他蛋白成分分离,收集LDL ,于PBS 平衡盐溶液中透析48h ,超滤除菌后4 ℃保存。LDL 的氧化修饰采用硫酸铜方法,不含EDTA 的LDL (1mg/ ml)置于含5μmol/ml Cu2 + 的PBS 中,37 ℃温育24h。修饰后的LDL 置于含200μmol/ ml EDTA 的PBS 中透析24h ,4 ℃保存。修饰程度测定采用硫代巴比妥酸反应法,以Lowrys 法测定蛋白浓度。

1．4 　细胞分离及流式细胞仪测定ABCA1 表达　实验6 周后,按照标准方法分离纯化兔单核细胞、腹腔巨噬细胞、腹部皮下脂肪细胞[3] 、肝细胞,调整细胞悬液浓度为2 ×105 / ml ,同时与小鼠抗人ABCA1 一抗(美国Santa Cruz Biotechnology 公司) 混合后置室温60min ,PBS 洗涤2 次,加入PE 荧光标记的羊抗小鼠二抗(美国Proteintech 公司) ,室温避光反应30min 后在流式细胞仪(美国BD 公司) 上检测细胞表面AB2CA1 表达量,结果以每100 个检测细胞中ABCA1 的平均含量表示。

1．5 　[3 H]胆固醇转出率测定　参照文献[3]方法,将收集到的腹腔巨噬细胞、脂肪细胞、肝细胞分别与DMEM(012 %BSA) 、[3 H]胆固醇(1μCi/ ml)及氧化修饰的低密度脂蛋白(Ox2LDL) (蛋白浓度30μg/ ml) 培养24h ,换液,以DMEM 培养液洗涤1 次后,加入DMEM培养液(012 %BSA)及apoA1(10μg/ ml ,Sigma 公司) ,培养6h 后收取培养液,利用液闪计数仪检测细胞溶解物及细胞介质的[3 H]放射量。胆固醇转出率用细胞介质中[3 H]胆固醇放射量占总放射量(细胞内+ 细胞介质)的百分比表示。

1．6 　主动脉、脂肪、肝脏组织脂质的萃取及胆固醇含量测定　6 周时处死动物,打开腹腔后取脂肪组织、肝组织、主动脉,按照文献[4]的方法粉碎后,按照标准方法萃取胆固醇,最后利用酶法通过752 型分光光度计检测组织胆固醇含量。

1．7 　AS 面积计算　6 周时处死动物,打开腹腔后取升主动脉至髂动脉分叉处血管,纵行剖开,以苏丹Ⅳ染色显示AS 病变区域,然后用数码相机拍摄,输入电脑,应用Image2Pro Plus Version 610 图像分析软件测量并计算AS 斑块面积(红色染色区域) 占血管内膜总面积的 ？

百分比。

1．8 　统计学处理　采用SPSS 1115 统计软件包进行分析,所有计量资料均以.x ±s 表示,组间采用两独立样本比较的t 检验并进行Person 相关性分析。P < 0105 为差异有统计学意义。

2 　结　　果

2．1 　血脂变化　建模前两组动物血脂水平差异无统计学意义( P > 0105) 。6 周后,烟酸组TC、非高密度脂蛋白胆固醇(NHDL2C ,为LDL2C 与VLDL2C 之和) 较对照组明显下降( P < 0101) ,而HDL2C、apoA1 则明显上升( P < 0101 ,表1) 。

表1 　两组血脂水平的比较(.x ±s ,n = 6)

Tab1 1 　Comparison on serum lipid levels between control andniacingroups (.x ±s , n = 6

TC(mmol/ L)             1。40 ±0126     24。11 ±2。80     1。47 ±0。13      17。23 ±1。37(1)

HDL2C(mmol/ L)         0。52 ±0。07    2。29 ±0。87      0。58 ±0。10      4。45 ±1。13(1)

apoA1(g/ L)              0。54 ±0。12    0。98 ±0。08      0。64 ±0。02      1。21 ±0。06(1)

　注:与对照组比较, (1) P< 0。01

2．2 　单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、肝细胞上ABCA1表达量的变化　6 周后,与对照组比较,烟酸组单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞表面的ABCA1 表达量明显升高,而肝细胞表面的ABCA1 表达量明显降低(表2) 。

2．3 　两组不同组织细胞胆固醇转出率的比较　6 周后,烟酸组巨噬细胞、脂肪细胞胆固醇转出率(分别为3.56 ±0.29、4.19 ±0135) 与对照组(分别为2152 ±0.34、3.09 ±0.08) 相比明显上升( t = 14.747 , P < 0.01 ;t = 9.697 , P < 0.01) ,而肝细胞胆固醇转出率(3.27 ±0.65)较对照组(4.77 ±0.33) 明显降低( t = 11.419 , P <0.01) 。

表2 　两组6 周后不同组织细胞中ABCA1 表达量的变化(.x ±s ,n = 6)

Tab1 2 　ABCA1 expression in different cells of the two groups af2ter 6 weeks (.x ±s ,n = 6)

对照组            3.64 ±0.37           19.68 ±9.10            21.72 ±4.54          2.35 ±0.32

t 值             7.101               10.081            6.488               9.347

2．4 　两组不同组织中胆固醇含量的变化　6 周后,烟酸组主动脉、脂肪组织、肝组织中的胆固醇含量(分别为1.30 ±0.08、1.27 ±0.14、0.71 ±0.09mmol/ g)与对照组(分别为1.65 ±0.18、1.89 ±0.11、0.95 ±0.11mmol/g)比较均明显减少( P< 0.01) 。

2．5 　两组的AS 病理改变　6 周后,肉眼观察可见对照组主动脉有明显粥样斑块形成,苏丹Ⅳ染色阳性区域明显,呈鲜红色息肉状、不规则或椭圆形,或呈散在颗粒状斑点;烟酸组斑块面积则较对照组显著减少(图1) 。对照组主动脉AS 面积占血管内膜总面积的百分比为10108 % ±1166 %,烟酸组为7191 % ±0136 %,两组差异具有统计学意义( t = 21873 , P = 01035) 。

图1 　两组主动脉斑块苏丹Ⅳ染色结果

A1 对照组;B1 烟酸组;箭头示AS 斑块

Fig1 1 　Aortic plaque stained by Sudan Ⅳin two groups

2．6 　腹腔巨噬细胞ABCA1 表达量与胆固醇转出率的相关性　对照组、烟酸组腹腔巨噬细胞上ABCA1 表达量与外周单核细胞( r = 0.883 , P = 0.020 ; r = 0.984 , P =0.000) 、脂肪细胞( r = 0.836 , P = 0.038 ; r = 0.950 , P =0.004) 、肝细胞( r = 0.847 , P = 0.033 ; r = 0.971 , P =0.001)的[3 H]胆固醇转出率均呈正相关。

3 　讨　　论

由胆固醇、磷脂与载脂蛋白结合形成的HDL2C 对防止AS 有重要作用。有研究证明,ABCA1 基因缺陷是Tangier 病的病因[5] ,从而使人们认识到ABCA1 具有主动转运细胞内胆固醇至细胞外的作用。ABCA1是由2261 个氨基酸组成的含有两个相似结构的膜蛋白,含有两个跨膜区和两个核苷酸结合区(NBD) [6] 。ABCA1 能介导胆固醇、磷脂及其他脂蛋白外流至细胞膜表面,与贫脂的apoA1 结合后可达到清除细胞内超载的胆固醇、增加RCT 的作用[7] 。

烟酸作为降脂药物具有独特的调脂功效,但早期因其具有皮肤潮红、肝毒性等不良反应而使临床应用受到了限制。随后的研究发现,烟酸是目前升高HDL2C效果最好及唯一能降低脂蛋白的药物,具有全面调脂作用。Birjmohun 等[8] 对烟酸升高HDL2C 的随机对照试验进行了荟萃分析,发现4749 例烟酸治疗患者中, TC、TG、LDL2C 分别降低了10 %、20 %、14 %,

HDL2C升高了16 %,主要冠脉事件降低了27 %。此外,烟酸还具有调脂以外的其他抗AS 作用,如延缓斑块的进展、促进斑块的逆转[9] 。体外研究发现,烟酸单独作用能明显增加冠心病患者单核细胞中ABCA1 的表达[10] ,且在3T32L1 脂肪细胞中可呈剂量依赖性地增加ABCA1 mRNA 的表达,促进apoA1 介导的胆固醇流出[11] ,并可显著上调ABCA1 的表达[12] 。

本研究结果显示,烟酸能降低血浆TC、NHDL2C 水平,升高具有抗AS 作用的HDL2C、apoA1 的水平,使肝细胞上ABCA1 的表达量降低,但可升高肝外组织细胞(单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞) RCT 关键基因ABCA1的表达。Jin 等[13] 报道,烟酸能使Hep G2 细胞清HDL2C、apoA1 的能力降低,但并不影响对胆固醇酯的清除。Zhang 等[14]研究发现,烟酸可通过降低ATP 合酶β链在Hep G2 细胞膜上的表达,起到升高HDL2C 的作用。由此推测,烟酸降低肝ABCA1 表达量后可能使肝细胞清除HDL2C、apo2A1 的能力降低,这可能是HDL2C升高的原因之一。Singaraja 等[15]报道,肝脏及外周AB2CA1 在RCT 中具有不同作用,但烟酸对肝ABCA1 表达量的影响在AS 进程中的作用尚需进一步研究。

本研究还证实烟酸能减少AS 面积及主动脉、脂肪组织、肝组织中的胆固醇含量。腹腔巨噬细胞上ABCA1 的表达量与外周单核细胞、脂肪细胞、肝细胞的[3 H]胆固醇转出率呈明显的正相关,能较准确地反映体内胆固醇代谢情况,是较好的检测指标。因此,烟酸是通过上调外周细胞(单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞)上ABCA1 的表达量,使外周细胞中胆固醇转出率

增加,提高RCT 的起始步骤来发挥其抗AS 及心血管保护作用的,但烟酸降低肝细胞ABCA1 表达的意义尚需进一步研究。

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